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IPHASE成功研發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1B1、OAT1、OCT2、MATE1、MATE2-K、P-gp!

更新時(shí)間:2024-10-25      點(diǎn)擊次數(shù):308

近年來,人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到,除了藥物代謝酶以外,藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體在許多藥物的吸收、分布和排泄中發(fā)揮著重要的作用。由于多態(tài)性或藥物-藥物相互作用(DDI)導(dǎo)致的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能喪失已被證明會(huì)導(dǎo)致藥物處置、療效甚至毒性發(fā)生顯著變化,進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的重要性,監(jiān)管機(jī)構(gòu)也期望新藥申請(qǐng)需進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)體的體外研究,以評(píng)估轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的DDI的潛在風(fēng)險(xiǎn)。


轉(zhuǎn)運(yùn)體介紹


轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporter)是一類表達(dá)于細(xì)胞膜的功能蛋白,在人體全身組織中均有表達(dá),通過影響藥物的吸收、分布和消除而影響藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征。介導(dǎo)藥物進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)體可將藥物攝取進(jìn)入組織器官,從而提升藥物生物利用度以及改變藥物的組織分布,屬于可溶性載體(Solute carrier,SLC)轉(zhuǎn)運(yùn)體;介導(dǎo)藥物外排的轉(zhuǎn)運(yùn)體可利用水解ATP的能量將某些藥物排出細(xì)胞,從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,產(chǎn)生耐藥性,屬于ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體。

圖片4.png


可溶性載體超家族是人類細(xì)胞膜上最重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體家族之一,它參與了細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸、能量傳遞、營養(yǎng)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等重要生理活動(dòng)。SLC超家族包括 52個(gè)亞家族,共有 400多名成員。臨床應(yīng)用中與DDI有關(guān)的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體大多是攝取型轉(zhuǎn)運(yùn)體,包括有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(organic cation transporter, OCT)2;有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(organic anion transporter, OAT) 1/3;有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporting polypeptide, OATP) 1B1/1B3;寡膚轉(zhuǎn)運(yùn)體(oligopeptide transporter, PEPT)1 等。其中,多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體(multidrug and toxin extrusion proteins, MATE) 1/2-K 是SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體,但屬于外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體。


ATP結(jié)合盒(ATP Binding Cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體是最大的轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族,分為ABCA~G共7個(gè)亞家族,屬于主動(dòng)運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)體,依賴于ATP發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)活性,以逆濃度梯度形式將藥物排出體外。參與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance protein,MRP)等。

圖片5.png


圖1 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在人體各組織器官中的分布


各國指導(dǎo)原則對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的要求


藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體是決定細(xì)胞內(nèi)藥物積累的關(guān)鍵因素,其活性往往與藥物的治療效果、毒性及藥物-藥物相互用 (Drug-drug interaction,DDI) 直接相關(guān)。美國、歐洲和中國的藥品監(jiān)管部門也相繼出臺(tái)指導(dǎo)原則,建議體外評(píng)估主要轉(zhuǎn)運(yùn)體與受試藥物之間潛在的相互作用,為體內(nèi)研究提供參考。


表1 各國指導(dǎo)原則對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的建議

類別

轉(zhuǎn)運(yùn)體

各國指導(dǎo)原則要求

FDA

NMPA

EMA

ICH

ABC

P-gp

BCRP

BSEP

×

×

最好考慮

×

SLC

OATP1B1

OATP1B3

OAT1

OAT3

OCT1

×

×

值得考慮

×

OCT2

MATE1

值得考慮

MATE2-K

值得考慮


“√"必須考慮;“×"不考慮


轉(zhuǎn)運(yùn)體研究體外模型


在開始轉(zhuǎn)運(yùn)體研究之前,一個(gè)重要的考慮就是選擇合適的體外試驗(yàn)系統(tǒng)。目前,指導(dǎo)原則推薦的體外評(píng)估由轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的DDI模型主要包括膜囊泡系統(tǒng)、基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及單向攝入的細(xì)胞系統(tǒng)等。


3.1 膜囊泡系統(tǒng)


轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的細(xì)胞的外翻膜囊泡系統(tǒng)是評(píng)價(jià)在研藥物是否為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(如P-gp、BCRP、BSEP等)的底物或抑制劑的常用模型。通常,膜囊泡可通過感染昆蟲細(xì)胞(如Sf9或Sf21),或轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如HEK293、HeLa、V79或MDCK)等進(jìn)行制備。囊泡外翻后,原本表達(dá)在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)體將被外翻至囊泡外,與藥物共孵育時(shí),藥物直接作用于外翻轉(zhuǎn)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到囊泡內(nèi),可檢測(cè)藥物的吸收而非外排,即測(cè)定囊泡內(nèi)藥物含量即可反應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)藥物的作用。

圖片6.png


圖2 膜囊泡系統(tǒng)的研究方案


3.2 基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)


基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是指能夠自發(fā)極化形成完整細(xì)胞單層的細(xì)胞系,如Caco-2、MDCK、LLC-PK1等。將細(xì)胞接種在Transwell小室上,培養(yǎng)至形成完整的極化細(xì)胞單層,將受試藥物添加到單層細(xì)胞的頂端(apical,AP)或基底側(cè)(basolateral,BL),測(cè)量滲透入接收室中的藥量,根據(jù)AP→BL(吸收)和BL→AP(流出)兩個(gè)方向上的表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient,Papp)計(jì)算外排率(efflux ratio,ER),評(píng)價(jià)化合物是否為該ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體底物。此外,通過測(cè)量探針底物在BL→AP方向的凈流量或ER值的變化,也可以進(jìn)行化合物對(duì)特定轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制作用的評(píng)估。


3.3 單向攝入的細(xì)胞系統(tǒng)


將重組轉(zhuǎn)運(yùn)體基因穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到不同的細(xì)胞系,可用于評(píng)價(jià)在研藥物是否為SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體(如OCTs、OATs、OATPs和MATEs)的底物或抑制劑。由于HEK293和CHO細(xì)胞具有低內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性并且易于維持的特點(diǎn),常用于表達(dá)攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)評(píng)價(jià)藥物是否為轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物時(shí),應(yīng)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的藥物攝取與親代或空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行比較,且應(yīng)比較有或無轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑時(shí)的藥物攝取。當(dāng)評(píng)估藥物是否為轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制劑時(shí),僅使用轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系評(píng)價(jià)已知探針底物的攝取便已足夠。


3.4三明治培養(yǎng)肝細(xì)胞


肝細(xì)胞中除了含有豐富的藥物代謝酶,還表達(dá)多種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體。三明治培養(yǎng)是將肝細(xì)胞培養(yǎng)于兩層膠原之間,底層為鼠尾膠使肝細(xì)胞貼壁,上層為Matrigen膠使其形成肝板樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)幾天后,肝細(xì)胞形成完整膽小管網(wǎng)絡(luò)并同時(shí)保持緊密連接,且肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體正常表達(dá)并定位于恰當(dāng)?shù)哪^(qū)域,可用于轉(zhuǎn)運(yùn)體功能研究。


試驗(yàn)系統(tǒng)——膜囊泡


應(yīng)用

•評(píng)估藥物與外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的相互作用

•確定底物特異性和確定抑制劑


優(yōu)勢(shì)

•適用于低通透性的化合物

•細(xì)胞毒性化合物不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

•重組系統(tǒng)中的高轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)可以在某些表達(dá)系統(tǒng)中“滴定"

•可以制備大量并冷凍保存以備隨時(shí)可用

•能夠預(yù)加載各種緩沖液和物質(zhì)

•準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)力學(xué),因?yàn)榉跤彌_液中的底物可以直接進(jìn)入活性位點(diǎn)


局限性

•不適合具有高滲透性或高非特異性結(jié)合的化合物

•昆蟲細(xì)胞中的低糖基化可能改變運(yùn)輸特性

•表達(dá)系統(tǒng)中的內(nèi)源性運(yùn)輸活性可能使數(shù)據(jù)解釋復(fù)雜化•轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性因批次而異

•如果在室內(nèi)制備(超離心或氮空化彈),則需要特殊設(shè)備


試驗(yàn)系統(tǒng)——單向攝入的細(xì)胞系統(tǒng)


應(yīng)用

•評(píng)估藥物與攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OATPs,OCTs, OATs,NTCP)的相互作用

•確定底物特異性并確定抑制劑


優(yōu)勢(shì)

•允許調(diào)查單個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特性

•穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以傳代多次使用或冷凍保存

•低復(fù)雜性


局限性

•宿主細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性可能使數(shù)據(jù)解釋復(fù)雜化

•穩(wěn)定重組細(xì)胞系的產(chǎn)生和表征是耗時(shí)的(>1個(gè)月)

•轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)室之間有所不同


試驗(yàn)系統(tǒng)——基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)


應(yīng)用

•評(píng)估外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)

•確定底物特異性并確定抑制劑

•定性地研究攝取和外排轉(zhuǎn)運(yùn)體之間的相互作用


優(yōu)勢(shì)

•運(yùn)輸受非特異性結(jié)合的影響較小,因?yàn)橹挥写┻^細(xì)胞單層的化合物才被測(cè)量

•適合評(píng)估主動(dòng)運(yùn)輸與擴(kuò)散


局限性

•內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性可能使數(shù)據(jù)解釋復(fù)雜化

•需要評(píng)估質(zhì)量平衡

•復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)研究

•除非攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共表達(dá),否則不適合低通透性的化合物


試驗(yàn)系統(tǒng)——肝細(xì)胞三明治模型


應(yīng)用

•評(píng)估肝臟攝取/外排和膽道排泄

•識(shí)別涉及肝膽藥物處置的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和限速步驟

•評(píng)估由于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制而引起的藥物性膽汁淤積的可能性

•調(diào)查攝取和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互作用

•評(píng)估藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度、Kpuu和亞細(xì)胞分布


優(yōu)勢(shì)

•系統(tǒng)模擬膽汁排泄,可以測(cè)量膽道清除率

•表達(dá)攝取和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、代謝酶和調(diào)節(jié)機(jī)制的整體系統(tǒng)

•可以使用從感興趣的物種中冷凍保存或新鮮分離的肝細(xì)胞

•適用于識(shí)別轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑(競(jìng)爭性和非競(jìng)爭性)和誘導(dǎo)劑

•在臨床前物種和人類中證明了體外對(duì)體內(nèi)的相關(guān)性


局限性

•需要一定的培養(yǎng)時(shí)間才能在合適的膜域中正確定位轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

•不太適合低清除率的化合物(特別是如果涉及代謝)

•酶/轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)/活性可能會(huì)受到培養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)


轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的關(guān)鍵點(diǎn)把控


4.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的關(guān)鍵點(diǎn)


目前,體外評(píng)估由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的DDI的常用模型為膜囊泡系統(tǒng)、基于極化細(xì)胞的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和三明治培養(yǎng)肝細(xì)胞。在實(shí)際應(yīng)用過程中,我們需綜合多方因素,選擇合適的試驗(yàn)系統(tǒng)。當(dāng)進(jìn)行ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的體外研究時(shí),以下幾點(diǎn)需要關(guān)注:


滲透性和吸附:當(dāng)評(píng)估轉(zhuǎn)運(yùn)體是否為在研藥物的底物時(shí),若所測(cè)試藥物具有高滲透性或強(qiáng)非特異性吸附等特性,可能會(huì)因?yàn)楸尘爸递^高而造成假陰性的結(jié)果。如使用膜囊泡研究具有高滲透性活強(qiáng)非特異性吸附的藥物,可能會(huì)因?yàn)楸粍?dòng)擴(kuò)散跨膜進(jìn)入膜囊泡導(dǎo)致高背景,掩蓋轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn),從而導(dǎo)致在囊泡模型中得到了假陰性的結(jié)果。


跨膜能力:如果在研藥物分子量大,不易透過細(xì)胞膜時(shí),細(xì)胞模型將無法研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,而膜囊泡模型則不受化合物滲透性的影響。藥物跨膜能力較差,能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的游離藥物濃度可能較低,而在膜囊泡模型中,藥物可以與轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)合位點(diǎn)直接接觸發(fā)揮其作用,并不需要透膜的過程。


輔因子:在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)考慮ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)共底物和輔因子的要求。例如,活細(xì)胞中以毫摩爾濃度存在的還原性谷胱甘肽是MRP1、MRP2、MRP2和MRP4轉(zhuǎn)運(yùn)某些底物所必需的;在某些情況下,谷胱甘肽轉(zhuǎn)運(yùn)與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。因此,試驗(yàn)中需額外添加適量的還原型谷胱甘肽或s -甲基谷胱甘肽。


4.2 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的關(guān)鍵點(diǎn)


體外評(píng)估由SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的DDI的常用模型為單向攝入的細(xì)胞系。當(dāng)使用單向攝入的細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行攝取研究時(shí),以下幾點(diǎn)值得考慮:


溶解度:在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí),應(yīng)考慮受試物的溶解度。為增加化合物的溶解度,可在不影響細(xì)胞活力或轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的情況下添加有機(jī)溶劑,如二甲基亞砜。對(duì)于溶解度低的化合物,可以在孵育緩沖液中加入白蛋白或其他賦形劑,但需要確定化合物處于未結(jié)合濃度,否則數(shù)據(jù)解釋將變得復(fù)雜。


試驗(yàn)程序:為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,試驗(yàn)過程需遵循一致的程序,盡量減小試驗(yàn)誤差導(dǎo)致的影響。攝取速率通常歸一化為細(xì)胞總蛋白(mg)或細(xì)胞數(shù),以便與親代或空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的攝取相比,準(zhǔn)確測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性攝取。


孵育時(shí)間:為了確定受試物的抑制作用,需根據(jù)受試物特性,如滲透性、是否為轉(zhuǎn)運(yùn)體底物等,考慮其與抑制劑的孵育時(shí)間(預(yù)孵育和/或共孵育)。


IPHASE轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)品


作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,IPHASE以HEK293為載體,成功推出全面匹配指導(dǎo)原則需求的SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞(OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2-K)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡(P-gp和BCRP)及配套產(chǎn)品,助力藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的DDI研究。

產(chǎn)品類別

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體

 

OCT2 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體

8-10million

MATE2-K SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體

8-10million

OAT1 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體

8-10million

OAT3 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體

8-10million

OATP1B1 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體

8-10million

OATP1B3 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體

8-10million

MATE-1 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體

8-10million

MOCK/HEK293F細(xì)胞

8-10million

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體

MDR1(P-gp)轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡

5mg/mL*0.5mL

BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡

5mg/mL*0.5mL

轉(zhuǎn)運(yùn)體輔助產(chǎn)品

優(yōu)選轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞培養(yǎng)基

30mL

轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液(pH7.4

50mL

轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液(pH8.0

100mL

轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液(pH8.4

100mL

轉(zhuǎn)運(yùn)HBSS BufferpH7.4

120mL

多聚賴氨酸包被板96

96/1

多聚賴氨酸包被板48

48/1

多聚賴氨酸包被板24

24/1

多聚賴氨酸包被板6

6/1

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡反應(yīng)液

50mL

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡MgATP溶液

25mL

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體囊泡MgAMP溶液

25mL

囊泡微孔過濾器封閉液

25mL

囊泡微孔過濾器

50個(gè)/


參考資料:


[1]洪梅,王旭陽.藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的翻譯后處置及相關(guān)關(guān)鍵位點(diǎn)研究進(jìn)展[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,43(06):160-172.


[2] Brouwer K L R , Keppler D , Hoffmaster K A ,et al.In vitro methods to support transporter evaluation in drug discovery and development.[J].Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2013, 94(1).DOI:10.1038/clpt.2013.81.


[3]《藥物相互作用指導(dǎo)原則2020》


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